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多色光譜拆分寬場熒光成像方法
點擊次數：1218 更新時間：2023-05-08
FLUOSYNC 一種快速而溫和的多色光譜拆分寬場熒光成像方法
FluoSync 是一種使用單次曝光同時進行多通道
熒光成像的精簡方法。
傳統的熒光成像方法通常按順序對每個通道成像，以減少熒光團之間的串擾。之前已單獨介紹了多光譜成像以及后續的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。每一種方法都需要進行繁瑣的手動調整或深入理解底層技術，或兩者都需要。徠卡顯微系統通過FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復雜性的同時保留了快速溫和成像的優點。FluoSync 會捕捉整個可見光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個信號，實現可靠的通道分離。多通道熒光成像從未如此容易。
多色寬場顯微成像
熒光顯微成像為研究蛋白質及其他生物分子的細胞功能提供了一種強大的工具。它具有能標記和跟蹤高特異性靶分子的*能力，因此已成為生命科學研究中不可少的一種工具。 抗體和遺傳標記可使用光譜可分辨的熒光染料來靶向和標記分子（見圖 1）。通過組合使用這些熒光標記，用戶可以跟蹤和研究樣本中不同標記的分子群體之間的行為和相互作用。常見的多色熒光成像方法需要考慮到熒光團信號的光譜重疊，這種現象通常稱為串擾或串色，如圖 1b 所示。通常，研究人員可通過將樣本中的染料數量保持在最少限度（即最多一種或兩種染料）來避免串擾，因為樣本中使用的染料越多，發生信號串擾問題的可能性就越大。 但是，隨著對生物學相關數據需求的日益增長，研究人員需要在一個樣本中觀察三個或更多事件，因此這種過于簡單的方法不再適用。在典型的多通道實驗中，通常使用一種或兩種熒光染料來識別特定的細胞結構，例如細胞核或線粒體，再使用額外的染料來識別感興趣的蛋白質。
光譜分離和拆解
在多通道方法中通常需要使用光譜分離良好的染料組合。如圖 1 所示，Alexa 488 與 Alexa 555 的組合就是一個很好的例子，兩者分別在光譜的綠色和紅色部分發光。但是，在使用多個熒光團染色的
樣本中，對染料進行光譜分離通常并不容易。染料的發射曲線可能部分重疊，導致一種染料發出的部分熒光信號落入其鄰近光譜的探測窗口。換句話說，來自綠色染料的一些信號會串色到紅色通道。在活細胞成像中這個問題可能更嚴重，因為用戶為了避免光毒性會嘗試避開光譜的藍色端。研究人員仍然需要使用多種染料來標記感興趣的蛋白質，但是受限于較窄的光譜區域，這增加了潛在的串擾問題。
有兩種常用的方法可對熒光信號進行光譜分解：使用特定的窄帶通光學濾色鏡和線性拆分（也稱為多光譜或高光譜成像）進行分離。使用特定的窄帶通光學濾色鏡進行通道分離簡單的多通道方法是按順序對染料成像。使用這種方法時，單獨激發樣本中的每種染料并探測其發射光。激發波長通過激發濾色鏡或特定波長的 LED 進行控制。熒光濾色塊中的帶通光學濾色鏡被移至每個圖像的光路中，以檢查到達樣本和探測器的光譜。最終的復合多色圖像是通過疊加單獨的曝光而產生的。按順序激發染料有助于減少串擾問題，但不能*將其消除。這種方法可能太慢，無法對快速的細胞事件成像，例如囊泡跟蹤或鈣成像。通常，感興趣的對象在兩個通道之間移動，因此如果不同時采集兩個通道，就無法在兩個通道中有效跟蹤該對象。此外，對多孔板等大型樣本成像時，長采集周期會顯著增加實驗的運行時間，導致工作效率下降。
為了加快采集過程，可以使用 Sedat 和 Pinkel 配置，將多帶通熒光濾色塊與快速的濾光片輪結合使用。這種小型濾光片輪的切換速度比熒光濾色塊快得多。多帶通熒光濾色塊會阻擋來自窄發射窗口之外的染料的熒光發射，因此可能會丟失寶貴的信號（參見圖 1a）。該技術還可能增加樣本光漂白，并降低最終圖像中的時間分辨率和信噪比水平。
線性拆分
另一種分離染料的方法是線性拆分，它使用數學拆分方法來分離通道。在這種方法中，顯微鏡收集樣本的多個圖像，每個圖像涉及不同的光譜帶（參見圖 2）。 所收集的數據包含每個像素的光譜曲線，以及來自所有熒光團的組合發射光譜。 接下來使用光譜線性拆分來量化每一群熒光團對信號的貢獻，然后生成多通道圖像。 在寬場成像中，該技術稱為多光譜成像。 在共聚焦成像中，系統通常可以用較高光譜分辨率進行掃描，這種方法稱為高光譜成像或蘭布達掃描。 除非您擁有能夠同時捕捉多個光譜窗口的專用硬件，否則這種方法需要對樣本反復曝光，導致有的光脅迫，因此不適合活細胞成像。線性拆分要求樣本中的每種染料有一個已知的參考光譜。 理想情況下，使用相同類型的樣本和制備方法采集參考光譜，以便系統能夠將染料信號與樣本*的背景噪聲和自發熒光區分開。線性拆分的基礎是將校準曲線中的信號水平與從真實樣本中采集的數據進行匹配。 如果染料濃度不同，即來自一個通道的信號比另一個通道的亮得多，可能會導致拆分誤差。 此外，如果存在探測器或光學噪聲（樣本背景熒光），還可能導致引入更多誤差來源。 這些弱點可能意味著線性拆分不適合光照強度低、背景噪聲高的樣本以及通道之間強度明顯不同的樣本。
熒光成像的精簡方法。
傳統的熒光成像方法通常按順序對每個通道成像，以減少熒光團之間的串擾。之前已單獨介紹了多光譜成像以及后續的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。每一種方法都需要進行繁瑣的手動調整或深入理解底層技術，或兩者都需要。徠卡顯微系統通過FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復雜性的同時保留了快速溫和成像的優點。FluoSync 會捕捉整個可見光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個信號，實現可靠的通道分離。多通道熒光成像從未如此容易。
多色寬場顯微成像
熒光顯微成像為研究蛋白質及其他生物分子的細胞功能提供了一種強大的工具。它具有能標記和跟蹤高特異性靶分子的*能力，因此已成為生命科學研究中不可少的一種工具。 抗體和遺傳標記可使用光譜可分辨的熒光染料來靶向和標記分子（見圖 1）。通過組合使用這些熒光標記，用戶可以跟蹤和研究樣本中不同標記的分子群體之間的行為和相互作用。常見的多色熒光成像方法需要考慮到熒光團信號的光譜重疊，這種現象通常稱為串擾或串色，如圖 1b 所示。通常，研究人員可通過將樣本中的染料數量保持在最少限度（即最多一種或兩種染料）來避免串擾，因為樣本中使用的染料越多，發生信號串擾問題的可能性就越大。 但是，隨著對生物學相關數據需求的日益增長，研究人員需要在一個樣本中觀察三個或更多事件，因此這種過于簡單的方法不再適用。在典型的多通道實驗中，通常使用一種或兩種熒光染料來識別特定的細胞結構，例如細胞核或線粒體，再使用額外的染料來識別感興趣的蛋白質。
光譜分離和拆解
在多通道方法中通常需要使用光譜分離良好的染料組合。如圖 1 所示，Alexa 488 與 Alexa 555 的組合就是一個很好的例子，兩者分別在光譜的綠色和紅色部分發光。但是，在使用多個熒光團染色的
樣本中，對染料進行光譜分離通常并不容易。染料的發射曲線可能部分重疊，導致一種染料發出的部分熒光信號落入其鄰近光譜的探測窗口。換句話說，來自綠色染料的一些信號會串色到紅色通道。在活細胞成像中這個問題可能更嚴重，因為用戶為了避免光毒性會嘗試避開光譜的藍色端。研究人員仍然需要使用多種染料來標記感興趣的蛋白質，但是受限于較窄的光譜區域，這增加了潛在的串擾問題。
有兩種常用的方法可對熒光信號進行光譜分解：使用特定的窄帶通光學濾色鏡和線性拆分（也稱為多光譜或高光譜成像）進行分離。使用特定的窄帶通光學濾色鏡進行通道分離簡單的多通道方法是按順序對染料成像。使用這種方法時，單獨激發樣本中的每種染料并探測其發射光。激發波長通過激發濾色鏡或特定波長的 LED 進行控制。熒光濾色塊中的帶通光學濾色鏡被移至每個圖像的光路中，以檢查到達樣本和探測器的光譜。最終的復合多色圖像是通過疊加單獨的曝光而產生的。按順序激發染料有助于減少串擾問題，但不能*將其消除。這種方法可能太慢，無法對快速的細胞事件成像，例如囊泡跟蹤或鈣成像。通常，感興趣的對象在兩個通道之間移動，因此如果不同時采集兩個通道，就無法在兩個通道中有效跟蹤該對象。此外，對多孔板等大型樣本成像時，長采集周期會顯著增加實驗的運行時間，導致工作效率下降。
為了加快采集過程，可以使用 Sedat 和 Pinkel 配置，將多帶通熒光濾色塊與快速的濾光片輪結合使用。這種小型濾光片輪的切換速度比熒光濾色塊快得多。多帶通熒光濾色塊會阻擋來自窄發射窗口之外的染料的熒光發射，因此可能會丟失寶貴的信號（參見圖 1a）。該技術還可能增加樣本光漂白，并降低最終圖像中的時間分辨率和信噪比水平。
線性拆分
另一種分離染料的方法是線性拆分，它使用數學拆分方法來分離通道。在這種方法中，顯微鏡收集樣本的多個圖像，每個圖像涉及不同的光譜帶（參見圖 2）。 所收集的數據包含每個像素的光譜曲線，以及來自所有熒光團的組合發射光譜。 接下來使用光譜線性拆分來量化每一群熒光團對信號的貢獻，然后生成多通道圖像。 在寬場成像中，該技術稱為多光譜成像。 在共聚焦成像中，系統通常可以用較高光譜分辨率進行掃描，這種方法稱為高光譜成像或蘭布達掃描。 除非您擁有能夠同時捕捉多個光譜窗口的專用硬件，否則這種方法需要對樣本反復曝光，導致有的光脅迫，因此不適合活細胞成像。線性拆分要求樣本中的每種染料有一個已知的參考光譜。 理想情況下，使用相同類型的樣本和制備方法采集參考光譜，以便系統能夠將染料信號與樣本*的背景噪聲和自發熒光區分開。線性拆分的基礎是將校準曲線中的信號水平與從真實樣本中采集的數據進行匹配。 如果染料濃度不同，即來自一個通道的信號比另一個通道的亮得多，可能會導致拆分誤差。 此外，如果存在探測器或光學噪聲（樣本背景熒光），還可能導致引入更多誤差來源。 這些弱點可能意味著線性拆分不適合光照強度低、背景噪聲高的樣本以及通道之間強度明顯不同的樣本。
圖 1a。 Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發射曲線。 兩個發射光譜的重疊顯而易見。 紅線表示 488 發射光濾光鏡的帶通。 只有在這條線下擬合的發射波長才能使其通過濾光鏡到達探測器。 紅色陰影區域顯示了 488 信號的一部分 (~20%) 被濾光鏡阻擋，減少與相鄰染料發生串擾。
圖 1b。 圖 1b 中的兩張圖像分別顯示了通道串色（左圖），以及使用帶通光學濾色鏡抑制這種現象（右圖）。 在這種情況下，對微管染色的紅色染料在線粒體圖像中清晰可見，因為圖像是使用多帶通熒光濾色塊采集的，但是探測器前面沒有發射光濾光鏡。 紅色染料（微管）與綠色染料（線粒體）交叉激發，導致通道串色嚴重。 在第二張圖像中，使用正確的發射光濾光鏡消除了串擾。
FluoSync
FluoSync 是一種快速、可靠的方法，能拆分來自樣本中多個熒光團的信號。它通過相量分析簡化了多光譜成像方法（Cutrale等人，2017 年），與較為傳統的多通道成像方法相比具有多項優勢。
FluoSync 通過探測器單次曝光同時激發和探測所有通道，從而采集多光譜圖像數據。此方法所用的探測器采用多個傳感器，每個傳感器采集光譜的不同部分。然后，使用基于相量的混合分解方法將產生的組合數據集分解。
由于同時采集所有熒光團，因此它比傳統方法的速度更快，成為活細胞成像和微量滴定板等大型樣本成像的理想解決方案。動態活細胞的同時成像得益于圖像采集的速度和高同步性。在采集來自兩個不同熒光團的信號之間，囊泡等快速移動對象不會產生位移。功能實驗（例如微量滴定板等較大樣本載體上的活細胞/死細胞實驗）成像將受益于速度優勢，并可將數據與另外的標記物相關聯，而不需要額外的采集時間。不同于依靠多個帶通熒光濾色塊阻擋部分發射信號以改善通道分離的方法，FluoSync 使用寬帶濾色鏡收集大部分發射信號，提供了一種同樣適用于弱光成像的高效探測解決方案。收集的光通過內置的光譜分離器進行分離。因此，等人認為基于相量的分析是一種對熒光壽命顯微成像 (FLI挑選和安裝合適的熒光濾色塊已成為歷史。基于相量的光譜拆分最初在2008年，Digman M) 進行可視化和快速分析的有效方法。后來，Fereidouni 等人和 Cutrale 等人先后在 2012 和 2017 年采用了該方法。根據經驗，轉換為相量后可將光譜表示在徑向顏色軸上，光譜寬度確定了光譜與原點的距離。兩種純染料的混合物會成為純染料之間的一條直線，而與純染料的距離代表了對整體信號的相對貢獻。適用于任何兩種染料的情況也適用于更多染料。每種可能的染料組合最終都會落在相量空間中的位置。
圖 1b。 圖 1b 中的兩張圖像分別顯示了通道串色（左圖），以及使用帶通光學濾色鏡抑制這種現象（右圖）。 在這種情況下，對微管染色的紅色染料在線粒體圖像中清晰可見，因為圖像是使用多帶通熒光濾色塊采集的，但是探測器前面沒有發射光濾光鏡。 紅色染料（微管）與綠色染料（線粒體）交叉激發，導致通道串色嚴重。 在第二張圖像中，使用正確的發射光濾光鏡消除了串擾。
FluoSync
FluoSync 是一種快速、可靠的方法，能拆分來自樣本中多個熒光團的信號。它通過相量分析簡化了多光譜成像方法（Cutrale等人，2017 年），與較為傳統的多通道成像方法相比具有多項優勢。
FluoSync 通過探測器單次曝光同時激發和探測所有通道，從而采集多光譜圖像數據。此方法所用的探測器采用多個傳感器，每個傳感器采集光譜的不同部分。然后，使用基于相量的混合分解方法將產生的組合數據集分解。
由于同時采集所有熒光團，因此它比傳統方法的速度更快，成為活細胞成像和微量滴定板等大型樣本成像的理想解決方案。動態活細胞的同時成像得益于圖像采集的速度和高同步性。在采集來自兩個不同熒光團的信號之間，囊泡等快速移動對象不會產生位移。功能實驗（例如微量滴定板等較大樣本載體上的活細胞/死細胞實驗）成像將受益于速度優勢，并可將數據與另外的標記物相關聯，而不需要額外的采集時間。不同于依靠多個帶通熒光濾色塊阻擋部分發射信號以改善通道分離的方法，FluoSync 使用寬帶濾色鏡收集大部分發射信號，提供了一種同樣適用于弱光成像的高效探測解決方案。收集的光通過內置的光譜分離器進行分離。因此，等人認為基于相量的分析是一種對熒光壽命顯微成像 (FLI挑選和安裝合適的熒光濾色塊已成為歷史。基于相量的光譜拆分最初在2008年，Digman M) 進行可視化和快速分析的有效方法。后來，Fereidouni 等人和 Cutrale 等人先后在 2012 和 2017 年采用了該方法。根據經驗，轉換為相量后可將光譜表示在徑向顏色軸上，光譜寬度確定了光譜與原點的距離。兩種純染料的混合物會成為純染料之間的一條直線，而與純染料的距離代表了對整體信號的相對貢獻。適用于任何兩種染料的情況也適用于更多染料。每種可能的染料組合最終都會落在相量空間中的位置。
圖 2。 概括了對含有多種熒光染料的樣本成像時的三種顏色分離方法。 通過比較發現，與傳統熒光成像方法相比，FluoSync 采集速度更快的優勢顯而易見。FluoSync 捕捉受激發染料的全發射光譜，因此光子不會被浪費，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測技術。
圖 3。 左側所示為藍色、綠色和紅色熒光團的三個單獨光譜。 使用相量分析時，每個純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個圓圈上表示，信號清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。 這些熒光團的任意組合也將落入特定空間。 圖中所示是三個熒光團中的每一個與所有三個熒光團的混合體的一種組合。 由于任何可能的熒光團組合也將落入“它們的"空間，因此可將光譜平均化以實現去噪。 右側圖是一個例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區域）。 降噪光譜表示所有貢獻熒光團的總和，它很好地填充了曲線下方的面積通過相量來表示光譜信息，可對圖像中的不同熒光組分進行實時、半盲的光譜分解。這種表示方法不僅局限于熒光標記，還可以去除自發熒光等無用信號，因此比線性拆分更加可靠。基于相量的光譜拆分方法適合用于分解最多 3 個熒光團的信號。超過 3 個熒光團時，相量方法仍然可以輕松識別最大的影響因素。拆分領域的新發展催生了一種混合拆分方法，它結合了基于相量的拆分和線性拆分這兩種方法的優點。
對混合光譜拆分的說明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨貢獻，甚至包括超過 3 種染料的情況（圖3）。與單純基于相量的拆分類似，具有相似熒光組分的所有像素都會落入相同的相量空間。因此，無論空間位置（即圖像中的原點位置）如何，它們都可被平均化以實現光譜去噪。 這樣，通過歧管進行的線性拆分操作次數（像素數，通常在百萬像素級別）通常會減到少于100,000次操作。然后對降噪光譜進行線性拆分，由此識別每種染料的亮度值。與線性方法相比，混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優勢，而不會影響可分離染料的數量。
總結與優勢
FluoSync是光學濾色鏡的數字迭代進步。這是一種可用于對多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光，并且可以使用自動光譜分解方法完成，因此可以更輕松、更快速地進行多色熒光成像。
與傳統成像技術相比，FluoSync 提供了高速、同步的多通道采集，同時利用了串擾而不是避免串擾。它是掃描大型樣本或捕捉活細胞快速動態過程的理想解決方案。最后，使用 FluoSync 時無需在實驗之間管理多組熒光濾色塊，從而簡化了實驗工作流程。因此，您可以專注于獲得結果，而不是研究顯微鏡。
優勢：
> 可使用不同的熒光團組合更加自由地進行多通道成像：您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數據生成效率： 能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔心串擾。
參考資料
Digman MA, Caiolfa VR, Zamai M, Gratton E。用于熒光壽命成像分析的相量方法。《生物物理學雜志》，2008 年Jan 15;94(2):L14-6.
F. Fereidouni, A. N. Bader, H. C. Gerritsen, Opt. Express 2012,20, 12729
Francesco Cutrale, Vikas Trivedi, Le A Trinh, Chi-Li Chiu, John MChoi, Marcela S Artiga & Scott E Fraser. 《自然·方法學》14,149–152 (2017)
對混合光譜拆分的說明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨貢獻，甚至包括超過 3 種染料的情況（圖3）。與單純基于相量的拆分類似，具有相似熒光組分的所有像素都會落入相同的相量空間。因此，無論空間位置（即圖像中的原點位置）如何，它們都可被平均化以實現光譜去噪。 這樣，通過歧管進行的線性拆分操作次數（像素數，通常在百萬像素級別）通常會減到少于100,000次操作。然后對降噪光譜進行線性拆分，由此識別每種染料的亮度值。與線性方法相比，混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優勢，而不會影響可分離染料的數量。
總結與優勢
FluoSync是光學濾色鏡的數字迭代進步。這是一種可用于對多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光，并且可以使用自動光譜分解方法完成，因此可以更輕松、更快速地進行多色熒光成像。
與傳統成像技術相比，FluoSync 提供了高速、同步的多通道采集，同時利用了串擾而不是避免串擾。它是掃描大型樣本或捕捉活細胞快速動態過程的理想解決方案。最后，使用 FluoSync 時無需在實驗之間管理多組熒光濾色塊，從而簡化了實驗工作流程。因此，您可以專注于獲得結果，而不是研究顯微鏡。
優勢：
> 可使用不同的熒光團組合更加自由地進行多通道成像：您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數據生成效率： 能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔心串擾。
參考資料
Digman MA, Caiolfa VR, Zamai M, Gratton E。用于熒光壽命成像分析的相量方法。《生物物理學雜志》，2008 年Jan 15;94(2):L14-6.
F. Fereidouni, A. N. Bader, H. C. Gerritsen, Opt. Express 2012,20, 12729
Francesco Cutrale, Vikas Trivedi, Le A Trinh, Chi-Li Chiu, John MChoi, Marcela S Artiga & Scott E Fraser. 《自然·方法學》14,149–152 (2017)
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